基于FFPE样本的单细胞、空间和原位分析技术联合揭示乳腺癌肿瘤微环境|Xenium专题

作者：Sarah E.B. Taylor和10x Development Teams

发表单位：10x Genomics

期刊名称：BioRxiv

发表时间：2022

所用组学：scFFPE-seq（10x FFPE单细胞测序）、Visium CytAssist（10x FFPE空间转录组测序）和Xenium In Situ（原位分析技术）

一、前言

10x Genomics推出的Xenium In Situ（原位分析技术）在组织层面将高通量基因/蛋白检测合二为一，简化实验流程的同时保留了组织完整性，实现了在单细胞分辨率下的空间转录组/空间蛋白质组的特征。此外，由于Xenium工作流程的非破坏性，可在同一切片中将基因表达和组织学结合在一起（H&E和IF染色），完美的在空间层面上将蛋白质、组织学和基因表达的数据定位在一张图谱中，展示出高复杂性、高通量、多模态的空间和细胞分辨率的数据。

Xenium In Situ结果图谱展示

二、研究背景

10x Genomics 单细胞测序技术可以根据单个细胞内全转录组基因表达和细胞表面蛋白数据，将单个实验中的数千到数百万个细胞聚类为不同的类型，从而解析人体中的每个细胞类型。10x Genomics Visium空间转录组测序技术可通过将基因组学、成像和组织病理学结合起来，实现空间层面上无偏倚的基因表达分析。Chromium数据具有单细胞分辨率，但缺乏相应的空间背景信息，而Visium数据具有空间背景信息，但可能需要与单细胞数据集成来推断细胞类型组成的详细情况。目前单细胞和空间转录组相互弥补，常用的是通过转录本分布预测和细胞类型反卷积进行两者的联合分析，得到空间层面的细胞聚类结果，但是仍然缺乏构成细胞间通信的高分辨率细胞-细胞和配体-受体相互作用，以及在空间背景下转录本在特定细胞中的定位信息。且这两种技术在实验过程中均会破坏组织，因此需要在连续切片之前或在连续切片上进行H&E和IF染色。针对此理想的解决方案是在不影响组织完整性的前提下提供高复杂性、高通量、多模态的空间和亚细胞分辨率的数据，并同时兼容新鲜冷冻（FF）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本。

在这篇文章中，首次采用新型的Xenium In Situ技术，该技术除了能够展示上述功能外，还能在同一组织切片上完成大的成像区域和基因表达与组织学图像（H&E和IF染色）的集合。此外，还介绍了用于RNA模板连接（RTL）的Chromium平台（Fixed RNA Profiling），并将其应用于FFPE组织（scFFPE-seq），大大解锁了单细胞的样本适用类型，同时提高了测序灵敏度。通过将scFFPE-seq、Visium和Xenium In Situ应用在单个FFPE保存的乳腺癌组织块的连续切片上（图1），展示了如何整合全转录组和靶向原位数据，以提供高度互补和可加性的生物学信息。scFFPE-seq和Visium注释到样本中的17种细胞类型，并通过将转录本映射到Xenium数据中达到进一步细化的目的。Xenium以单细胞分辨率在空间层面上解析这些细胞类型及其基因表达谱。且由于Xenium工作流程的非破坏性，促使其能在同一切片中将基因表达和组织学结合在一起（H&E和IF染色），这实现了在空间层面上将蛋白质、组织学和基因表达的数据定位在一张图谱中。

scFFPE-seq、Visium CytAssist和Xenium In Situ联合分析，完美的将基因表达和组织学结合在一起，解锁了在空间层面上对同一个FFPE切片进行基因表达和蛋白质的检测。

三、实验设计

scFFPE-seq、Visium CytAssist和Xenium In Situ 3种技术联合分析同一FFPE组织样本：

scFFPE-seq实验设计：从FFPE样本中分离细胞核，进行Fixed RNA 单细胞测序流程；使用的样本为Visium CytAssist和Xenium In Situ实验所用切片相邻的组织切片；

Visium CytAssist实验设计：采用CytAssist进行空间层面的全转录组分析，采用的样本为scFFPE-seq相邻的组织切片；

Xenium In Situ实验设计：

Ø 首先将5μm的组织切片放置在Xenium载玻片上，并利用特异性DNA探针杂交靶向到mRNA上，进行滚环扩增（RCA，Rolling circle amplification）。

Ø 其次，将Xenium载玻片放置到Xenium Analyzer仪器中进行荧光探针杂交（使用特定的携带荧光的探针对滚环复制后的target进行多轮检测）、循环成像、解码和数据分析，从而解析空间层面亚细胞的转录组图谱。

Tips：Xenium原位分析使用针对目标转录本的可循环探针，然后进行酶扩增，以创建荧光探针杂交的靶标。在Xenium分析仪上，组织的显微镜图像检测每个荧光探针的位置，然后将其移除。连续几轮的荧光探针杂交、成像和去除创建了一个独特的光学特征，揭示了在一个组织中每个细胞内一个位置上的RNA的信息。Xenium可在同一组织切片中检测RNA和蛋白质，揭示复杂且微妙的基因表达模式。

 Xenium In Situ技术原理

 图1：实验设计

四、研究结果

1、 scFFPE-seq、Visium CytAssist揭示人乳腺癌FFPE组织    

乳腺癌是一种具有多种病理特征的复杂疾病：每种肿瘤亚型都有独特的特征和显著的细胞和分子异质性。为了更好地理解肿瘤的发生及其微环境，在空间层面上，全面解析其细胞成分和分子图谱是异常重要的。基于现有的技术，采用单细胞和空间转录组对乳腺癌（II-B期；2*25μm FFPE切片用于scFFPE seq检测；5μm FFPE切片用于Visium CytAssist检测；ER+/PR−/HER2+）样本进行了表征。

scFFPE-seq转录组的数据表明，一共鉴定到了17种细胞类群，细胞的基因中位数为1480。

 图2：scFFPE-seq细胞聚类及注释结果

接下来，对收集到的scFFPE-seq相邻的5μm组织切片进行了Visium CytAssist分析，一共得到了17个空间聚类结果（与单细胞聚类结果一致存在一定的偶然性），平均基因中位数为5712。

 图2：Visium CytAssist空间聚类及注释结果

基于此及通过前期文献调研，对细胞类群进行了注释（图2A）并将其结果映射到了空间维度上（图2B，C）。其中在对空间聚类进行注释的时候发现10个Visium簇具有比较明确的细胞类型或疾病状态（图2B），而其他7个簇则显示具有混合的细胞类型组成的特征。Visium CytAssist和scFFPE-seq联合分析确定了三个具有不同簇的肿瘤区域的空间位置，包括两种分子上不同类型的导管原位癌（DCIS：DCIS #1和#2），以及侵袭性肿瘤区域（图2C）。

 图2：CytAssist前进行的H&E染色显示与（B）中细胞群的空间分布

2、Xenium分析展示了单细胞分辨率下的空间转录组特征    

进一步，文中首次利用Xenium分析仪以目标基因定制panel生成具有极高分辨率的基因表达数据（图3）。通过对人乳腺健康组织和肿瘤组织进行了Xenium分析，选用的panel为Xenium人乳腺组织的280个基因和33个定制基因，共313个基因进行探究。将一个周期解码后的原始荧光图像可视化，显示出高分辨率的组织的详细结构（图3A）。

此外，通过采用Xenium分析软件对数据进一步分析时，通过从panel中选择相关基因，以识别基质细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肌上皮细胞、内皮细胞、DCIS和侵袭性肿瘤细胞（图3B）。文中还对Xenium分析后的样本进行了H&E染色，结果表明即使在Xenium分析后，组织完整性仍然完好无损（图3C）。

图3：Xenium数据展示极高分辨率下单细胞和目标基因panel的空间定位信息

3、Xenium可视化细胞分割支持单细胞和空间转录组数据整合及基准测试    

基因-细胞矩阵或基因-Spot矩阵是单细胞和空间转录组学的标准输出格式，可以输入到各种社区开发的工具中，包括那些集成不同数据模式的工具（Seurat）。为了使Xenium数据也能以这种格式输出，首先需要在图像上定义细胞边界，然后将转录本分配给各个细胞中（类似于单细胞转录组学中的 cell-calling stages）。为了实现这一目标，采用DAPI检测核并向外扩展，直到达到15 μm的最大距离，或到达另一个细胞的边界。细胞分割边界可以使用Xenium Explorer软件进行可视化（图3D），以标准基因-细胞矩阵格式输出Xenium数据，其中转录本被明确地分配给细胞。在这部分分析中，共鉴定到了167885个总细胞，36944521个总转录本，转录本中位数为166（图3E，F）。当将scFFPE-seq数据映射到Xenium panel上的313个基因时，观察到scFFPE-seq的每个细胞基因中位数为34个，而Xenium panel数据中每个细胞的基因中位数为62个。阴性对照探针占总数的0.026%。解码对照占总计数的0.01%。

 图3：Xenium数据展示极高分辨率下单细胞和目标基因panel的空间定位信息

4、scFFPE-seq数据证明Xenium基因panel可代表人乳腺癌组织中的主要细胞类群    

为了进一步验证包含313个基因的人乳腺panel的数据准确性，分析了panel中的基因在预期细胞类型中的相对表达量。将scFFPE-seq和Xenium数据转换为相同的基因-细胞矩阵格式并进行降维和t-SNE分析。通过将受监督的scFFPE-seq注释转移到Xenium数据中；在Xenium的数据中，86%的细胞被明确地识别为单一细胞类型。通过过滤了整个scFFPE-seq数据，仅筛选出了Xenium人乳腺panel中使用的313个基因，并发现识别出了相同的细胞类型（图3G），揭示Xenium人乳腺panel可真实地捕捉到其生物异质性。

虽然Xenium中分析的细胞数量更多且具有更高的密度，但通过将转录本准确分配到细胞中，可以从Xenium数据中识别出与单细胞数据相同的预期细胞类型（图3H，I）。文中绘制了确定的细胞类型的定位，并生成一个Xenium空间图谱（图3J）。脂肪细胞是唯一没有映射到Xenium数据的细胞类型，因为scFFPE-seq并没有根据已知的脂肪细胞标记物将这些细胞作为一个独特的簇分离出来。与Visium一样，Xenium成功地识别了脂肪细胞标记物的位置，但由于甘油三酯占据了细胞的大部分，因此在脂肪细胞转录本绕过细胞边界的地方提供了精细的分辨率。对两个连续切片的Xenium分析显示了该技术的可重复性，重复切片的细胞类型比例几乎相同，转录本计数高度相关（r² = 0.99）。

 图3：Xenium数据展示极高分辨率下单细胞和目标基因panel的空间定位信息

 5、技术对比：Xenium检测具有高灵敏度和特异性检测RNA转录本    

Xenium和scFFPE-seq是新技术，因此，相对于使用新鲜或冷冻细胞的现有Chromium技术，对它们彼此的灵敏度进行基准测试是明智的。使用基因中位数的表达来量化各自的敏感性，排除高表达或低表达基因的干扰。当测序在不同平台上的深度保持不变时（每个细胞约10000 reads），scFFPE-seq的基因中位数敏感性高于现有的10x单细胞平台（Chromium 5’基因表达（GEX）和3’基因表达（GEX））。为了进一步确定Xenium和scFFPE-seq的比较基准，将每个细胞的转录本数量（Xenium）与每个细胞的UMIs数量（scFFPE-seq）进行了比较，并过滤到Xenium panel上的基因数量。结果表明Xenium的敏感性比scFFPE-seq高1.4倍（图4A）。

 图4：Xenium、Visium和scFFPE-seq以特异性和灵敏度为比较基准

接下来，通过对相应的H&E图像进行配准来比较Visium和Xenium数据，以识别公共捕获区域用于后续分析（占完整Visium数据集的78%）（图4B）。以肿瘤相关的上皮标记物TACSTD2为例，Visium和Xenium表现出一致的空间表达特征（图4C，D）。通过将Xenium表达数据映射到Visium捕获区域，并计算每个Visium点内的pseudobulk counts（图4E）。与Visium相比，人乳腺探针panel上的基因中位数敏感性提高了8.4倍（图4F）。为了检测特异性，文中比较了Visium和Xenium的TACSTD2转录本数量，观察到二者具有强相关性（r²=0.88）（图4G），Xenium平台的敏感性大大增加。

 图4：Xenium、Visium和scFFPE-seq以特异性和灵敏度为比较基准

虽然比较单个基因可以对Xenium工作流程进行基准测试，但原位分析的真正魅力在于能够以高分辨率为基准在空间上定位多个基因。这在许多细胞类型共存的情况下特别有用，因为这一现象并不能被其他scRNA-seq和当前基于捕获的空间转录组学方法解决。当分析该组织中的一个非典型导管增生（ADH）区域时，Xenium能够清楚地定位8种不同细胞类型的关键标记物（图4H-J）。

 图4：Xenium、Visium和scFFPE-seq以分辨率为比较基准

 6、Xenium允许RNA和蛋白质在同一组织切片中同时进行可视化分析   

虽然有一些技术可以同时分析RNA和蛋白质的表达，但很少有方法允许在同一切片上同时可视化这两种分析物。Xenium实验过程中，没有破坏蛋白表位，因此后续还可以进行IF实验分析蛋白信息（图5）。FFPE的解交联中不仅有助于DNA探针靶向RNA的可及性，而且还可作为抗原修复步骤。自发荧光猝灭大大提高了信噪比。在Xenium实验流程之后，在同一切片上进行标准免疫荧光染色，结果表明蛋白表位被保留了下来。利用荧光基团偶联的二抗检测HER2（肿瘤）和CD20（B细胞）抗体，并将其表达与同源RNA进行比较（图5A，B）。结果表明它们的空间表达高度相关，这进一步突出了Xenium探针的特异性和解码特性。进一步，通过将两幅最大强度投影DAPI图像（Xenium和免疫荧光显微镜）相互配准，并将蛋白质和RNA数据叠加在一起（图5C-E）。实验结果表明RNA和蛋白质表达谱之间具有高度一致性。

 图5：来自Xenium的RNA和蛋白免疫荧光可以在同一组织切片中可见

 7、Chromium和Xenium通过对细胞类型组成和差异基因表达分析揭示FFPE样本肿瘤微环境    

导管原位癌（DCIS）是浸润性导管癌的一种非专性前体，可发展为侵袭性疾病，其治疗通常包括手术切除病变和放射治疗。由于并非所有DCIS病变都会发展为侵袭性疾病，因此研究人员对了解DCIS侵袭性的分子机制非常感兴趣，且可以协助制定更好的治疗策略。通过采用Xenium和scFFPE-seq数据来识别不同的肿瘤亚型，并用分子靶点来弥补H&E成像和病理学不足。

首先，通过对scFFPE-seq数据进行分析，将三种不同的肿瘤上皮细胞亚型和两种肌上皮细胞亚型映射到Xenium数据中。进一步选择了三个感兴趣的区域（ROIs）：DCIS #1、DCIS #2和浸润性肿瘤（图6A）。病理学专家验证了这些区域的存在，他们还观察到1）Xenium实验后的切片进行 H&E染色表现出与标准H&E染色相当的高质量形态结构，2）3个ROIs要么在形态上表现出不同，要么被独特的微环境所包围。病理学专家注释之后显示，DCIS #1的ROI具有较小、圆形的实质型中度核级导管增生，细胞在大小、形状和位置上有轻到中度的变化，可变的粗染色质，细胞核也呈现不同程度的突出。DCIS #2 的ROI表现出弥散在间质结缔组织的浸润性癌病变，周围聚集着大量高增殖导管原位癌，并伴有两个中央粉刺样坏死灶的形成。

通过对scFFPE-seq数据分析确定了Xenium数据中ROIs中15种细胞类型的占比，包括淋巴细胞、巨噬细胞、间质细胞、肌上皮细胞和侵袭性细胞。本文发现了ROI中细胞类型组成的四个主要差异（图6B）。ACTA2+肌上皮细胞在DCIS#2 ROI中表现显著，在DCIS #1 ROI中较少见，在侵袭性ROI中缺失，侵袭性肿瘤细胞在DCIS #2 ROI中被检测到，在侵袭性ROI中内皮细胞数量略多。验证实验进一步证明了这些发现（图6C），表明Xenium和scFFPE-seq数据如何揭示仅与H&E病理不明显的分子差异的。DCIS #2 ROI比DCIS #1 ROI含有更多的侵袭性细胞，KRT15+肌上皮细胞较少，这表明DCIS #2 ROI比DCIS #1 ROI更具侵袭性。侵袭性ROI中侵袭性细胞类型被检测到的概率极高，而肌上皮细胞类型完全缺失。Xenium的高分辨率使相邻细胞之间的相互作用能够被捕获。这在DCIS #2 ROI中得到了很好的证明，ACTA2+肌上皮细胞的边界包围着侵袭性细胞（图6C）。

 图6：scFFPE-seq和Xenium联合分析探究DCIS亚型和侵袭性肿瘤区域之间的细胞类型组成和分子标记的差异性

最后，文章中绘制了代表7种主要细胞类型的典型标记物的表达和肿瘤亚型之间的差异表达基因，以便深入探究DCIS ROI是否进展到侵袭性状态（图6D）。这些分析显示，MZB1是DCIS #1 ROI和细胞类型的独有标记物，在DCIS #2 ROI中发现存在GJB2+基质细胞，ALDH1A3，KRT15和KRT23在DCIS #1 ROI中肌上皮细胞中高表达，侵袭性ROI中巨噬细胞标记物MMP12没有被检测到。

 图6：scFFPE-seq和Xenium联合分析探究DCIS亚型和侵袭性肿瘤区域之间的细胞类型组成和分子标记的差异性

 8、Visium和Xenium联合分析可从感兴趣的ROI中获取全转录组信息  

肿瘤的激素受体状态具有重要的生物学和临床意义。雌激素和孕激素在青春期乳腺上皮细胞的发育中发挥作用，而暴露于卵巢类固醇与患乳腺癌风险相关。临床上，乳腺癌是根据雌激素受体（ER / ESR1）、孕激素受体（PR / PGR）和人表皮生长因子受体2 （HER2 / ERBB2）的表达进行分类的。这些分类通常和治疗策略相关；例如，内分泌疗法通常用于治疗ER+乳腺癌患者。本研究中使用的组织块被注释为HER2+/ER+/PR−。Xenium数据显示ERBB2+（HER2+）和ERBB2+/ESR1+（HER2+/ER+）基因表达（图7A）。然而，在脂肪细胞区域内有一个小的DCIS区域，该区域为三阳性ERBB2+/ESR1+/PGR+（HER2+/ER+/PR+）。通过Xenium、H&E和细胞类型标记放大这个三阳性ROI，发现该区域主要是DCIS #2肿瘤上皮细胞，没有鉴定到KRT15+肌上皮细胞层（图7B-D）。

 图7：Visium和Xenium联合分析揭示三阳性受体ROI中差异表达基因

接下来，进一步比较了Xenium和scFFPE-seq数据中三个激素受体基因的表达（图7E-F）。虽然在scFFPE-seq数据中很少发现PGR+细胞，且它们似乎与ESR1或ERBB2的表达并不一致。在Visium数据中，该区域只有5-6个Spots（图7G），导致其没有被注意到。但是，采用Visium方法从这个三阳性区域获得完整的转录组信息被证明是至关重要的，该数据能够将这个三阳性区域识别为Cluster12的一部分，并在脂肪细胞区域发现了5个Spots（图7H）。使用点插值方法，通过可视化这个三阳性区域内的细胞类型占比，并选择了包含DCIS #2细胞类型的6个Spots（图7I）。然后，对这6个Spots与所有其他Visium点进行了全转录组差异基因表达分析，一共鉴定出94个差异表达基因（log₂FC >1.5；p值< 0.05）；图里显示了其中4个基因（图7J）。

 图7：Visium和Xenium联合分析揭示三阳性受体ROI中差异表达基因

 9、总结    

在这篇文章中，通过采用三种独立且互补的技术探究单个FFPE样本的生物学信息。上述结果表明这些技术的集成是一个迭代过程，并提出了一种数据模式的发现如何迅速激发另一种数据模式的探索。文章详细的展示了这3种最新的技术之间如何进行联合分析，这一结果并不是单一测序结果能达到的水平。此外，还总结了3种技术各自的优势，scFFPE-seq作为上述三种技术中最敏感的，特别是对低表达基因，结果表明scFFPE-seq的灵敏度比匹配样本的 Chromium 5'和3'单细胞数据高。在本文中所介绍的三种与FFPE兼容的检测方法中，scFFPE-seq是唯一一种在单细胞分辨率下提供完整转录组数据的方法，因此非常适合用于建立疾病基线、注释细胞类型以及设计或验证靶向的Xenium基因Panel。与scFFPE-seq一样，Visium也能提供完整的转录组数据。Visium目前缺乏真正的单细胞分辨率，但它提供了一个单细胞技术无法探索的空间背景。由于两种技术使用的探针集相同，对scFFPE-seq和Visium数据进行联合分析相对简单，并且允许对组成Visium Spots的细胞类型进行精确的反卷积。

 Xenium In Situ优势

Xenium在组织层面上将高通量基因/蛋白检测合二为一，不依赖高通量测序平台，简化了实验流程，完美展示了在单细胞分辨率下的空间转录组/空间蛋白质组的原位特征。如您有开展Xenium In Situ的意向，欢迎联系我们！

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